Анализ днк впч вкр 18 типа

Так и возникают новообразования. В него помещают образец биоматериала. Вирус 16 и 18 типа обычно никак себя внешне не проявляет поэтому в данном случае использование таких препаратов считается нецелесообразным. Его стали относить к типам со средней онкогенностью. Инфекция, вызываемая вирусом папилломы человека. Иммуноферментный анализ позволяет выявить количественное и качественное содержание антител в биоматериале. К таким препаратам можно отнести Гепон и Изопринозин.

Виды скрининга на ВПЧ ВКР

Тест на вирус папилломы человека (ВПЧ-тест) является надежным помощником врачу: выявление вируса обращает особое внимание врача на проблему возможного развития рака, вынуждает В кванте 21 впч 44 типа. Анализ днк впч вкр 18 типа. Читать ещёТест на вирус папилломы человека (ВПЧ-тест) является надежным помощником врачу: выявление вируса обращает особое внимание врача на проблему возможного развития рака, вынуждает провести дополнительные обследования. Следует добавить, что на данный момент во многих европейских странах используется цервикальный скрининг, включающий в себя регулярное обследование женщин на вирус (ВПЧ-тест) и/или ПАП-тест (определяет изменения в клетках, связанные с вирусом). Каждая женщина проходит такое обследование раз в 3—5 лет. В кванте 21 впч 44 типа. Анализ днк впч вкр 18 типа. 4 обнаружен тип впч что это. 11 типов впч высокого канцерогенного риска. Скрыть. Вирус папилломы человека (ВПЧ) долгое время способен существовать в организме, проявляя себя только при ослаблении Количественный анализ, или Дайджен-тест (Digene-тест), строится на принципе гибридного захвата ДНК. Читать ещёВирус папилломы человека (ВПЧ) долгое время способен существовать в организме, проявляя себя только при ослаблении иммунной защиты. Чтобы выявить инфекцию, применяются различные виды анализов, позволяющие определять болезнь на ранней стадии и проводить эффективное лечение. Содержание статьи: 1 Разновидности анализов и техника проведения. Количественный анализ, или Дайджен-тест (Digene-тест), строится на принципе гибридного захвата ДНК. Для проведения анализа проводится забор биологического материала с пораженного участка (методом соскоба или мазка). Техника позволяет определять стадию развития патологии и тип штамма. Скрыть. Чтобы не пропустить вирус папилломы человека высокого канцерогенного риска, наше здравоохранение проводит скрининг населения. Если анализ на ВПЧ ВКР положительный, дополнительно назначается кольпоскопия. Читать ещёЧтобы не пропустить вирус папилломы человека высокого канцерогенного риска, наше здравоохранение проводит скрининг населения. Это определенная стратегия медицинских учреждений, которая помогает выявить вирусоносителей ВПЧ и не допустить преобразования этого вируса в онкологическое заболевание. Для этого разработана специальная схема анализов, график посещения специалиста и, если понадобится современное лечение. Папилломавирус. Если анализ на ВПЧ ВКР положительный, дополнительно назначается кольпоскопия. Для этого используется прибор кольпоскоп. Это бинокуляр с осветительным прибором, который позволяет врачу лучше рассмотреть влагалище и шейку матки. Скрыть.

ПЦР на ВПЧ ВКР скрининг (15 типов количественно)

При скрининге с использованием количественных тестов принимают во внимание только клинически значимый результат. Для дифференциальной диагностики и наблюдения пациентов после проведения лечения дополнительная ценность одиночного количественного определения не показана. Генотипирование вирусов папилломы человека.

Цель генотипирования ВПЧ — отличие персистирующей инфекции от случая повторного инфицирования сохранение генотипа в повторных тестах ; уточнение тактики ведения больных в зависимости от онкогенности выявленных типов вируса. Распространение получили методики с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза генотипирование по величине амплифицируемого фрагмента , гибридизации на плашках и стрип-полосках, ПЦР в реальном времени.

Классические методики, использующие принцип гибридизации со специфическими зондами позволяют определять наиболее широкий спектр генотипов 20— Однако использование для амплификации универсальных праймеров приводит к существенным различиям в аналитической чувствительности выявления различных генотипов ВПЧ, приводя к заметным искажениям результатов.

Кроме того, широкий спектр определяемых генотипов необходим только для научных исследований. Методики, основанные на применении типоспецифических олигонуклеотидов, позволяют проводить типирование спектра клинически значимых генотипов и в заметной степени лишены проблемы различий аналитической чувствительности по отношению к разным генотипам ВПЧ. Предпочтение должно отдаваться мультиплекс-методикам с использованием ПЦР в реальном времени как наиболее быстрым, контаминационно безопасным, предполагающим возможность автоматизации.

Может проводиться сокращенное генотипирование с выявлением только наиболее онкогенных типов ВПЧ 16 и Для установления персистенции вируса применяют подход повторного генотипирования через 12 месяцев. Выявление наиболее онкогенных типов ВПЧ 16 и 18 может указывать на потребность в более агрессивной тактике ведения больных более частые повторные визиты, более тщательное обследование для выявления предраковых изменений и др.

Предпочтение должно отдаваться быстрым и контаминационно-безопасным методикам, таким как ПЦР в реальном времени. Некоторую дополнительную ценность имеет выявление 42, 43 и 44 генотипов. Количественное определение не оправдано. При планировании беременности может быть рекомендована выжидательная тактика.

При наличии беременности ее прерывание или родоразрешение методом кесарева сечения не оправданы, так как риск развития папилломатоза гортани ниже риска возможных осложнений указанных операций. Но персистенция вируса в эпителии шейки матки в течение длительного времени может вызывать его патологические изменения. Папилломавирусы могут оказывать продуктивное и трансформирующее воздействие на слизистую оболочку.

Проявлением продуктивного воздействия являются папилломы и кондиломы, проявлением трансформирующего — дисплазии в различной степени, внутриэпителиальный рак и инвазивный рак или рак шейки матки. Рак шейки матки — один из немногих видов злокачественных новообразований, для которых установлена основная причина возникновения заболевания. Многочисленными исследованиями по-казано, что ДНК вируса папилломы человека обнаруживается практически при всех случаях предраковых состояний и при раке шейки матки.

Положительный тест на определение ДНК HPV типов 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58, 59, 67 у женщин старше 30 лет может свидетельствовать о персистенции вируса. Чувствительность теста в комбинации с цитологическим исследованием в обнаружении предраковых изменений шейки матки и рака шейки матки намного выше, чем проведение только цитологического исследования.

Если у матери, страдающей остроконечным кондиломатозом, рождается ребенок, он также инфицируется и впоследствии у него также могут появиться остроконечные кондиломы или папилломатоз гортани и дыхательных путей рассмотрено выше. Однако частота таких симптомов у грудных детей крайне низкая.

У детей достаточно высокий уровень иммунитета, который предохраняет их от подобных проявлений инфекции. На голосовых связках появляются множественные наросты-папилломы. Вызывается вирусом 11 типа. Иногда появляется у детей, рожденных женщинами, имеющих остроконечные кондиломы.

Мелкие плоские бляшки-бородавки несколько похожие на плоские бородавки появляются вокруг половых органов. Чаще развивается у мужчин, постоянно меняющих половых партнеров.

Вызывается типами — 16, 18, 31, 33, 42, 48, 51, Д Дисплазия шейки матки. Более грозные клиническое проявления ВПЧ-инфекции у женщин — это цервикальная интраэпителиальная неоплазия или дисплазия шейки матки и рак шейки матки см на фото.

Это наиболее частый вид злокачественного течения данной инфекции. Более подробная статья про CIN и дисплазию — здесь. Подробная статья о том, что такое эрозия шейки матки и чем она отличается от дисплазии и ВПЧ — здесь. Ж Сегодня некоторые зарубежные ученые считают, что вирус папилломы человека является причиной появления рака любой локализации. Поскольку рак — это злокачественная опухоль эпителия кожи или слизистой оболочки, следовательно, вирус ВПЧ, вызывающий диспластические явления как раз в эпителии, и вызывает появление рака.

Это интересно:  Как избавиться от бородавок на пальцах в домашних условиях

Есть доказательства при раке молочной железы и раке гортани, правда еще не оформленные в общемировые рекомендации. И, как считают некоторые исследователи рака, не за горами тот день, когда рак другой локализации например, кишечника также признают результатом деятельности в организме человека вируса папилломы человека. Основной способ диагностики папилломавируса — реакция ПЦР. Наиболее распространенные виды анализа на ВПЧ — 16, 18 типы вируса, а также ряд других высокоонкогенных типов.

Материал для анализа берут со слизистой влагалища и шейки матки женщины. У мужчин — со слизистой полового члена. Реакция ПЦР может дать и ложный результат, причем как ложноположительный, так и ложноотрицательный результат, особенно если нарушены условия ее проведения даже толчок стола, на котором проводится исследование, может привести к такому ложному результату.

И этот факт не зависел от сложности оборудования и от качества реактивов. Новое исследование, набирающее популярность в медицинской среде.

Этот тест используется для определения наличия клинически значимых концентраций вируса. Благодаря этому тесту, можно выявить — высокая степень онкогенности у вирусов, находящихся в организме больного, или низкая. Digene-тест используется в комплексе с цитологическим исследованием шейки матки, и оцениваются они также комплексно.

Исследуется мазок, взятый при гинекологическом осмотре. При этом врач-лаборант под микроскопом определяет наличие или отсутствие патологически измененных клеток, которых в норме быть не должно, а появляются они только при развитии заболевания. Наличие таких измененных клеток может свидетельствовать о наличии CIN или дисплазии шейки матки у женщины.

Исследуется микроскопический кусочек ткани, взятый также при гинекологическом или урологическом обследовании. Под микроскопом врач оценивает степень изменения ткани, взятой на исследование.

Вирус папилломы человека- одно из самых распространённых и популярных в мире заболеваний, от которого страдают миллионы людей. Вирус достаточно быстро мутирует, а на сегодняшний день учеными установлено около типов папиллом, из которых только 80 досконально изучено.

Некоторые их типы неопасны для человека, а, другие- 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 и т. Папилломы 16 и 18 типа провоцируют онкологические заболевания малого таза у женщин. ВПЧ 16 и 18 типа означают крайне высокий риск таких онкологических заболеваний, как дисплазия, рак шейки матки, половых органов, влагалища. Он выявляется у многих женщин в ходе гинекологического скрининга, что дает понять лечащему врачу о возможных угрозах и рисках онкологии.

Выявление данных типов вируса еще не означает сам рак, а всего лишь указывает на высокую возможность его появления и прогрессирования. Вирус папилломы данных типов прогрессирует на слизистых оболочках и в глубоком слое эпителиальных клеток половых органов, цервикального канала. Данные типы вирусов опасны в основном для женского репродуктивного здоровья, а для мужчин папиллома 16 и 18 типа не является таким опасным недугом, так как они чаще всего являются всего лишь транзиторными носителями кратковременное носительство, которое долго не сохраняется в организме поэтому при совместном обследовании партнеров или супругов подобный вирус обычно у мужчины не обнаруживается, но, вероятно, он в свое время явился переносчиком заболевания.

Основная причина заболеваемости ВПЧ — это начало половой жизни. Частые случайные связи, смена партнеров, незащищенные сексуальные контакты являются главными провокаторами вируса папилломы человека. Бытовой путь заражения происходит крайне редко, а некоторые исследования его и вовсе отрицают, но со счетов это списывать нельзя.

Такое заражение возможно через определенные предметы личной гигиены полотенце, постельное белье , открытые ранки и трещины, куда легко попадает вирус, а также в результате соприкосновения с ними здорового человека. Еще один способ инфицирования приходится на момент родов женщины. Когда плод ребенка проходит через инфицированные родовые пути, то возможно его заражение вирусом.

У новорожденного, как правило, в горле и на коже образуются кондиломы, но все это излечимо, а ребенок в скором времени будет здоров. Симптоматика ВПЧ 16 и 18 типа , как правило, долго себя не проявляет, и женщина вообще не чувствует никаких симптомов. Когда иммунитет ослабевает, а защитные силы организма снижаются, то на коже половых органов могут появиться высыпания. Его вызывает вирус 16 типа. Заболевание хорошо поддается лечению, но в определенных случаях оно может перейти в рак кожи.

Для ВПЧ 16 и 18 типа несвойственно, но в то же время не исключено образование остроконечных кондилом, бородавок или каких-то других наростов на коже и слизистых половых органов. Диагностика вируса и онкологических изменений, как правило, не представляет никакого труда, а выявить наличие заболевания можно несколькими анализами и тестами:.

Все эти выше указанные исследования позволяют врачу установить полную клиническую картину и выявить все риски заболевания, чтобы вовремя начать лечение или провести другие обследования. В любом случае врач проводит серию тестов, чтобы точно узнать состояние пациентки, потому что по одному анализу невозможно сразу же установить диагноз или наличие вируса, так как нередко результаты бывают противоречивые.

Это значит, что особо важно правильно диагностировать любое состояние пациентки и не заниматься лечением несуществующих болезней. Стоит сразу же отметить, что выявление в ходе анализов и тестов ВПЧ 16 и 18 типа не означает смертельный приговор или непременно онкологию. Если, кроме присутствия онкогенного вируса, никакой другой патологии не обнаружено, то требуется дальнейшее лечение и постоянное наблюдение у лечащего врача.

Женщине в таком случае нужно будет регулярно или раз в год сдавать анализы, проходить кольпоскопию и цитологические исследования, чтобы еще на ранних стадиях выявить все изменения и злокачественные процессы. Однако, нередко ВПЧ вызывает клеточные и тканевые изменения органов малого таза, цервикального канала. В таком случае лечение будет совсем другим. Вирус 16 и 18 типа очень часто приводит к дисплазии шейки матки или ее предраковому состоянию, которое делится на 3 стадии.

Без должного лечения, примерно через 10 лет ,этот недуг мутирует в рак шейки матки или третью стадию дисплазии. Поэтому всегда нужно тщательно следить за своим состоянием здоровья и регулярно проходить осмотр у врача. Во-первых, не стоит паниковать, так как необходимо сразу же обратиться к врачу-гинекологу , который проведет осмотр и дальнейшее лечение или проведет дополнительные тесты, так как у анализов методом ПЦР часто бывают ложноположительные результаты поэтому врач в любом случае перепроверит диагноз.

А затем нужно следовать дальнейшим инструкциям и рекомендациям доктора, который потом назначит лечение и скажет, что делать дальше и нужно ли бить тревогу. Если пациентка обнаруживает у себя на коже бородавки или другие остроконечные кондиломы, то вирус 16 или 18 типа тут, как правило, не при чем, так как подобные клинические проявления вызывают вирусы других типов.

Это интересно:  О чем говорит появление новых родинок

Цитомегаловирус, Вирус папилломы человека Тип 16, 18

Разработка тест-системы для скринингового выявления 11 генотипов ВПЧ высокого канцерогенного риска в формате клинически значимого количества, основанной на ПЦР с детекцией флуоресцентного сигнала по конечной точке (FEP)
Автор: Насонова В.С., Куевда Д.А., Шипулина О.Ю. Организация: ФГУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия

По данным Международного агентства по изучению рака ВОЗ рак шейки матки (РШМ) одно из наиболее распространённых онкологических заболеваний, занима ющее второе место по частоте встречаемости среди женщин во всём мире, уступая только раку молочной железы. Ежегодно в мире диагностируется около 500 тысяч случаев заболеваний, и 250 тысяч пациентов умирают.
В ходе многочисленных исследований была установлена этиологическая роль вирусов папилломы человека (ВПЧ) типов высокого канцерогенного риска (ВКР) в развитии предраковых поражений и РШМ. На сегодняшний день охарактеризовано 15 генотипов ВПЧ высокого канцерогенного риска: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82 — с которыми связано 95,3% случаев заболеваний РШМ. В клинической практике очень важна ранняя диагностика заболевания.
Одним из первых и основных методов диагностики предраковых поражений стал цитологический анализ мазка. Однако он является субъективным методом и зависит от квалификации врача. Поэтому программы цитологического скрининга не сумели существенно уменьшить частоту развития РШМ. Международным агентством по изучению рака ВОЗ рекомендовано включение в программы популяционного скрининга молекулярные тесты для выявления ВПЧ.
В России диагностика ВПЧ-инфекции преимущественно основывается на применении ПЦР с электрофоретической детекцией. Этот подход связан с высоким риском контаминации помещения и получения ложноположительных результатов. Контаминационно безопасной и недорогой методикой является качественная ПЦР с флюоресцентной детекцией продуктов амплификации после окончания реакции, без открывания пробирок.
Согласно недавним исследованиям, важное значение для прогноза течения ВПЧ-инфекции имеет вирусная нагрузка. Выявление вируса в количестве не ниже определенного порогового уровня (порога клинической значимости), имеет малое клиническое значение, так как говорит о высокой вероятности спонтанного излечения и практически полном отсутствии риска прогрессии. Считается, что для целей скрининга данный порог обязателен к использованию: положительными учитываются только случаи вирусной нагрузки превышающей порог. Для послеоперационного мониторинга, выявление вируса даже с низкой нагрузкой может быть ранним маркером рецидива, потому введение порога в этом случае не оправдано. Ранее нами была проведена работа по созданию количественной методики определения нагрузки ВПЧ на основе ПЦР в реальном времени, и был определен согласующийся с данными литературы пороговый уровень клинически значимого количества вируса – 3lg (10^3) г.э. ВПЧ приходящиеся на 10^5 клеток.
До настоящего времени предлагаемые тесты, основанные на флуоресцентной детекции, качественно выявляли только 16 и 18 типы ВПЧ ВКР с которыми ассоциировано не более 71,5% случаев возникновения РШМ, или дорогостоящие количественные тесты на основе ПЦР в реальном времени.
Нашей целью стала разработка методики выявления широкого спектра генотипов ВПЧ, ассоциированных более чем с 93% случаев РШМ, использующую принцип детекции флуоресценции по конечной точке. А так же создание стандартизированной методики взятия материала и пробоподготовки, которая позволит использовать качественный ВПЧ-тест в формате выявления только клинически значимых инфицирований вирусом.
Цели исследования

Разработка системы олигонуклеотидов (праймеров и зондов), позволяющие амплифицировать и осуществлять детекцию специфических геномных участков 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58, 59, 67 типов ВПЧ, а так же β-глобинового гена человека в качестве эндогенного внутреннего контроля (контроль за взятием, транспортировкой, хранением образца, выделением ДНК и проведением ПЦР).
Определение аналитической чувствительности и специфичности разработанной методики.
Сравнение с альтернативными методами выявления ВПЧ.
Разработка стандартизированной методики взятия материала и пробоподготовки для использования качественного ВПЧ-теста в формате выявления только клинически значимой вирусной нагрузки.
Определение диагностической чувствительности разработанной методики.

Материалы и методы исследования

Для дизайна олигонуклеотидных последовательностей использовался пакет программ Vector NTI 9 (InforMax Inc., 2003), а так же был разработан математический алгоритм поиска консервативных фрагментов последовательностей в пределах группы для последующего выбора группоспецифичных олигонуклеотидов.
Для оценки аналитической чувствительности и специфичности использовались плазмидные контроли ВПЧ высокого канцерогенного риска: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58, 59, 67 (разработанные в ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора); ВПЧ кожных типов: 1, 3, 4, 5, 7, 8, 15, 20, 24, 27, 37, 38, 49, 50, 65 (любезно предоставленные докторами M. Favre и E.M.de Villiers).
Сравнение разработанной методики выявления ВПЧ проводилось с «nested»-ПЦР с использованием рекомендованных для выявления ДНК ВПЧ международных праймерных систем MY11/MY09 и GP5+-GP6+ праймерами MY11/09, GP5+/6+ выявляющими как ВПЧ ВКР, так и низкого канцерогенного риска (НКР), и рекомендуемой FDA для использования в клинико-лабораторной практике тест-системой «Hybrid Capture II HPV test» (Digene) выявляющей ВПЧ ВКР.
Оценка диагностической чувствительности была проведена на 87 клинических образцах с цитологическими признаками тяжёлой дисплазии (H-SIL) и гистологически подтверждёнными ЦИН3 или РШМ. Диагностическая чувствительность и специфичность оценивались на 214 клинических образцах цитологической нормы (без цитологических признаков цервикальных интраэпителиальных неоплазий).

Результаты и обсуждение

С учётом дизайна олигонуклеатидов, был проведён подбор условий амплификации выбранных геномных участков в мультиплексной ПЦР. В результате олигонуклеотиды были объединены в 2 смеси с детекцией сигнала по двум флуоресцентным каналам. Первая смесь включает в себя детекцию 31, 35, 39, 59 типов ВПЧ ВКР по одному каналу, и 16 тип ВПЧ, как наиболее онкогенный, по другому каналу. Вторая смесь выявляет 18, 33, 45, 52, 58, 67 типы ВПЧ по одному каналу, и β-глобиновый ген человека по второму каналу. Для флуоресцентных детекторов, имеющих 3 и более каналов флуоресцентной детекции, олигонуклеотиды были модифицированы для выявления всех перечисленных генотипов ВПЧ в одной пробирке по трём каналам, включая — β-глобиновый ген человека (в качестве эндогенного внутреннего контроля).
Аналитическая чувствительность метода оценивалась с использованием 10-ти кратных разведений контрольных ДНК соответствующих типов, и составила 5*102 г.э. /мл для всех типов ВПЧ. Аналитическая специфичность метода оценивалась с использованием плазмидных контролей ВПЧ кожных типов, ВПЧ НКР (низкого канцерогенного риска), а так же с использованием плазмидных контролей различных микроорганизмов: Аденовируса типов 2, 3, 7, Цитомегаловируса, вируса Эпштейна-Барр, вируса ветряной оспы, вируса гепатита В, С, вируса иммунодефицита человека первого типа, вируса герпеса человека типов 6, 8, вируса простого герпеса, Chlamydia trahomatis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureoplasma urealyticum, Gardnerella vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Candida albicans, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus в концентрациях 108 г.э./мл, в ходе исследования перекрёстных реакций обнаружено не было.
Аналитическая чувствительность амплификационной части разработанной методики сравнивалась с альтернативными методами выявления ДНК ВПЧ – c универсальными консенсусными праймерами MY09/11, GP5+/6+ и Hybrid Capture II (hc2) ВПЧ тестом (Digene). Сравнение проводилось на контрольной панели ДНК ВПЧ ВКР с последовательными 10-кратными разведениями ДНК 8 генотипов ВПЧ ВКР в ТЕ-буфере. В результате сравнения трёх методов выявления ДНК ВПЧ было получено, что Hybrid Capture II (hc2) ВПЧ тест (Digene) имеет чувствительность 105 г.э./мл для всех типов ВПЧ (что соответствует порогу клинически значимого количества вируса). Выявление ДНК ВПЧ универсальными праймерами MY09/11, GP5+/6+ сильно зависело от типа ВПЧ: 10^3 г.э./мл было только для 16, 33 и 45 типов, для 18, 31 и 59 типов – 10^4 г.э./мл, для 52 типа – 10^5 г.э./мл, чувствительность выявления 39 типа наиболее низкая – 10^6 г.э./мл. Вариация чувствительности может быть связана с наличием вырожденных нуклеотидов для некоторых типов ВПЧ в последовательности универсальных праймеров, в том числе и для 39 типа. Разработанная тест-система имеет одинаково высокую чувствительность выявления 10^3 г.э./мл для каждого типа ВПЧ ВКР.
Ввиду того, что hc2 ВПЧ тест (Digene) позволяет выявлять, согласно данным литературы, только клинически значимое количество вируса, а разработанный нами тест имеет превосходящую чувствительность, мы провели попытку создания такого алгоритма использования теста на принципе разведения образца, чтобы он выявлял только клинически значимое количество вируса. Для этого было необходимо, в первую очередь провести стандартизацию взятия материала и экстракции ДНК. Основным критерием выбора было 1) наличие достаточного количества материала после взятия и экстракции (оценивалось по количеству ДНК человека в специальной методике, основанной на количественной ПЦР в реальном времени; критерием служило наличие ДНК человека в концентрации не менее 5*10^4 г.э./мл) 2) минимальный разброс по количеству ДНК человека от образца к образцу (ввиду того, что при использовании качественных тестов не представляется возможным проведение нормализации на количество геномов человека, разрабатываемая методика должна давать максимально близкий выход ДНК человека). В ходе испытаний была подобрана следующая схема: взятие материала осуществляется цервикальной цитологической щеткой в 500 мкл транспортной среды АмплиСенс с муколитиком (производство ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора). Щетка обламывается и сохраняется в транспортной среде до доставки в лабораторию. Далее осуществляется экстракция ДНК методом аффинной сорбции на частицах силикагеля («ДНК Сорб-АМ», производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора) согласно инструкции. Апробация подобной методики на 643 образцах показала, что экстрагируемое количество ДНК человека составляет 6,54 lg (+- 0,31 lg) или 3,47*10^6 — 7,08*10^6 г.э./мл, разброс является приемлемым.
Подобранная схема была использована для оценки алгоритма использования тест-системы для выявления клинически значимого количества вируса. Клинические образцы с установленным цитологическим и/или гистологическим диагнозом норма или реактивные изменения (214 образцов) и диагнозом тяжелая дисплазия (H-SIL) или рак шейки матки (РШМ) (87 образцов). Сбор образцов и экстракция ДНК проводилась по методике, описанной выше. Диагностическая чувствительность и специфичность сравнивались с тест-системой hc2 ВПЧ-тест (Digene). Т.к. чувствительность hc2 ВПЧ-теста (Digene) для выявления клинически значимого количества вируса составляет 10^5 г.э./мл, а чувствительность разработанной тест-системы на 2 порядка выше — 10^3 г.э./мл, т.о. при разбавлении выделенной ДНК на 2 порядка, мы могли выровнять чувствительность для двух тест-систем. Далее осуществлялась постановка ПЦР с разведением ДНК на 2 порядка и без него. Без разведения ДНК ВПЧ выявлена в 98,9% случаев (86 из 87), при осуществлении разведения экстракта ДНК на 2 порядка (предположительно выявление только значимого количества вируса) – так же в 98,9% (86 из 87). При попытке повысить пороговое значение (произвести разведение на 3 порядка) количество выявленных случаев H-SIL и РШМ снизилось и составило 92,0% (80 из 87). Таким образом диагностическая чувствительность составила 98,9% для исходной выделенной ДНК, так и при разведении на 2 порядка. При исследовании образцов нормы или реактивных изменений ДНК ВПЧ выявлена в 38,3% образцов (82 из 214) (специфичность 61,7%). Проведение разведения на 2 порядка позволило отсечь 59,8% ВПЧ положительных образцов с диагнозом норма или реактивные (49 из 82) как содержащих незначимое количество вируса. Таким образом при использовании порога клинической значимости ДНК ВПЧ в образцах нормы или с реактивными изменениями (осуществление разведения экстракта ДНК на 2 порядка) выявляется в 15,4% (33 из 214) (специфичность 84,6%).

Это интересно:  Как избавиться от кондилом на языке

Выводы
Нами была разработана тест-система для выявления широкого спектра генотипов ВПЧ высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58, 59, 67), основанная на ПЦР с детекцией флуоресценции по конечной точке. Тест-система обладает высокой чувствительностью (98,9%) и высокой специфичностью (84,6% — в формате выявления клинически значимого количества вируса), что позволяет её использовать для проведения скринингового обследования женщин с целью выявления группы риска развития тяжёлых дисплазий и рака шейки матки. Кроме того, данная тест-система позволяет выявлять 16 тип ВПЧ как наиболее онкогенный тип высокого канцерогенного риска.
При обнаружении этого типа рядом зарубежных исследователей (Castle, 2005) рекомендовано изменение алгоритма скринингового обследования. Данная методика является достаточно простой для проведения исследования, контаминационно безопасной и не требует высокотехнологичного дорогостоящего оборудования. А так же была разработана методика, позволяющая использовать качественный ВПЧ-тест в сочетании с описанным методом взятия клинического материала и экстракции ДНК (ДНК-сорб-АМ) для выявления только клинически значимых инфицирований вирусом папилломы человека и доказана ее эффективность на клинически охарактеризованных образцах.
Следует особо подчеркнуть, что подобный результат не может быть перенесен без соответствующего клинического подтверждения на другие методы взятия клинического материала, экстракции ДНК и другие качественные ВПЧ-тесты ввиду возможных их отличий по количеству и разбросу при взятии материала, эффективности экстракции и аналитической чувствительности ПЦР-методик.
Дополнительным удобством является то, что разработанная схема не изменяет описанных производителем в инструкциях протоколов экстракции ДНК или постановки ПЦР. Добавлениями являются жесткие требования к взятию материала (использование цитологических щеток, транспортной седы с муколитиком, сохранение щетки в образце до доставки в лабораторию) и этап разведения препарата ДНК после экстракции и перед ПЦР на 2 порядка (в 100 раз).

Статья написана по материалам сайтов: www.jks-k.ru, gynecolog.net.

»

Помогла статья? Оцените её
1 Star2 Stars3 Stars4 Stars5 Stars
Загрузка...
Добавить комментарий

Adblock detector